Svelare il processo di scissione del DNA dell'enzima Sau3AI

Sau3AI è un enzima di restrizione di tipo II ampiamente utilizzato per la manipolazione genetica, come la costruzione di librerie genomiche. Sau3AI è costituito da due domini, il dominio N-terminale (Sau3AI-N) e il dominio C-terminale (Sau3AI-C). Il modo in cui questi due domini lavorano insieme per tagliare il DNA rimane poco chiaro.

Recentemente, un gruppo di ricerca guidato dal Prof. YU Feng dello Shanghai Advanced Research Institute (SARI) dell'Accademia cinese delle scienze e dal Prof. HE Jianhua dell'Università di Wuhan ha segnalato un meccanismo di autoattivazione in cui il dominio C-terminale Sau3AI apre il Dominio catalitico N-terminale attraverso effetti allosterici per ottenere la scissione di siti specifici del DNA.

I risultati sono stati pubblicati su Structure il 30 agosto.

A causa dell'attività di scissione del DNA, Sau3AI non può essere espresso in Escherichia coli e quindi un mutante del sito catalitico, Sau3AI-E64A, è stato utilizzato per l'espressione esogena e la ricerca strutturale. La struttura cristallina del mutante Sau3AI-E64A rivela che quando il DNA non è legato, una regione ad anello (333-342) del dominio C-terminale pende sul sito di legame del DNA del dominio N-terminale, impedendo al dominio N-terminale di legarsi a DNA.

L'analisi del dominio C-terminale Sau3AI e della struttura del complesso del DNA ha indicato che la regione dell'anello (261-268 e 280-295) del dominio C-terminale era significativamente alterata dopo il legame al DNA, il che implica che Sau3AI può subire cambiamenti conformazionali dopo il dominio C-terminale dominio si lega al DNA.

Inoltre, i ricercatori hanno condotto un esperimento di gel shift sui mutanti dei residui amminoacidici chiave che legano il DNA (K257A, S424A e T435A) nel dominio C-terminale per confermare che il DNA che lega il C-terminale svolge un ruolo cruciale nell'attivazione dell'attività catalitica di N- dominio terminale. Questi risultati suggeriscono che il dominio C-terminale attiva l'attività enzimatica del dominio N-terminale attraverso effetti allosterici.

I ricercatori hanno suggerito che Sau3AI è un enzima di restrizione di tipo IIE, ma a differenza di altri enzimi di restrizione di tipo IIE, è monomerico anziché omodimero. Due diversi domini in Sau3AI svolgono un ruolo simile agli omodimeri in altri enzimi di restrizione di tipo IIE, suggerendo che Sau3AI rappresenta una nuova sottoclasse di enzimi di restrizione di tipo IIE.