Trapianto di FVIII/ET3

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4206 (2023) Citare questo articolo

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L’emofilia A è la malattia emorragica legata all’X più comune che colpisce più di mezzo milione di persone in tutto il mondo. Le persone con emofilia A grave hanno livelli di FVIII della coagulazione <1% e sperimentano sanguinamenti spontanei debilitanti e potenzialmente letali. I progressi nelle terapie per l’emofilia A hanno migliorato significativamente i risultati sanitari, ma lo sviluppo di anticorpi inibitori del FVIII e i sanguinamenti interrotti durante la terapia aumentano significativamente la morbilità e la mortalità dei pazienti. Qui utilizziamo feti di pecora all'equivalente umano di 16-18 settimane di gestazione e mostriamo che il trapianto prenatale di cellule placentari umane (107-108/kg) bioingegnerizzate per produrre una proteina FVIII ottimizzata, determina un aumento considerevole dei livelli plasmatici di FVIII che persiste per > 3 anni dopo il trattamento. Le cellule si innestano negli organi principali e nessuno dei riceventi sviluppa risposte immunitarie alle cellule o al FVIII che producono. Pertanto, questi studi attestano la fattibilità, il vantaggio immunologico e la sicurezza del trattamento dell’emofilia A prima della nascita.

L'emofilia A (HA), la malattia emorragica legata all'X più comune, si verifica in 24,6 casi su 100.000 nati vivi maschi e colpisce oltre mezzo milione di individui in tutto il mondo1. Le persone con HA grave (PHA) hanno <1% dei normali livelli plasmatici di attività del FVIII e vanno incontro a sanguinamenti spontanei potenzialmente letali, inclusi ematomi del tessuto connettivo/muscolare, emorragie interne ed emartri che portano ad artropatie croniche debilitanti2. Nonostante gli ultimi progressi nelle attuali terapie, che hanno sostanzialmente migliorato lo standard di cura3, il carico di malattia nella PHA continua ad essere elevato, come la malattia articolare, lo sviluppo di anticorpi inibitori nel 25-40% dei pazienti, entro i primi 50 giorni di esposizione al FVIII, e la prevenzione di emorragie interattive e/o pericolose per la vita continua a rappresentare una sfida4,5.

Uno studio recente ha dimostrato che per i nati affetti da emofilia, le possibilità di vivere una vita di durata e qualità normali saranno ridotte del 33% nei paesi ad alto reddito e del 93% nei paesi a basso reddito1. Queste statistiche che fanno riflettere dimostrano che ci sono ancora urgenti bisogni clinici non soddisfatti che richiedono lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per aumentare la sopravvivenza e la qualità della vita in questi pazienti.

Il trattamento delle malattie genetiche durante il periodo prenatale mediante il trapianto in utero (IUTx) è stato eseguito in modo sicuro per decenni negli esseri umani sotto uso compassionevole6. Recentemente, sono stati avviati studi clinici che hanno reclutato soggetti per stabilire la sicurezza e la fattibilità dell'uso di IUTx per trattare feti affetti da α-talassemia (NCT02986698), osteogenesi imperfetta (NCT03706482) o malattie da accumulo lisosomiale (NCT04532047). Questi studi attestano il cambiamento tanto necessario nella prospettiva di come possono essere trattati i pazienti con disturbi monogenici e hanno ulteriormente stabilito la sicurezza di questo tipo di procedure sia per le donne in gravidanza che per i soggetti affetti7.

Circa il 70% delle persone affette da HA ha una storia familiare della malattia, il che consente la diagnosi e l'intervento prenatale. Lo sviluppo di terapie prenatali in grado di fornire livelli di FVIII curativi o sufficienti a convertire un disturbo emorragico grave e pericoloso per la vita in un fenotipo lieve, inducendo contemporaneamente tolleranza immunitaria al prodotto FVIII ed eliminando così il rischio di formazione di inibitori del FVIII , avrebbe un impatto benefico importante sull'aspettativa di vita e sulla qualità della vita dei pazienti con HA e trasformerebbe lo standard di cura nel trattamento dell'HA8,9.

Mentre la terapia genica in utero ha mostrato grandi promesse negli studi preclinici10, la trasduzione di cellule in vitro consente garanzie nella produzione che non sono possibili con l'iniezione diretta del vettore ed elimina il rischio di trasdurre inavvertitamente tessuti/cellule indesiderati, ad esempio quelli della linea germinale. Inoltre, la IUTx che utilizza cellule che proliferano fisiologicamente in vivo e secernono livelli clinicamente terapeutici di FVIII è un approccio promettente e sicuro per fornire una correzione permanente/a lungo termine di HA6. Abbiamo recentemente riportato che le cellule placentari umane (PLC) sono un'eccellente piattaforma cellulare per produrre e secernere il FVIII in vivo quando trasdotte con un lentivettore che codifica per un FVIII bioingegnerizzato ottimizzato per il codone mieloide (PLC-mcoET3)11. Qui, utilizzando pecore selvatiche come modello animale di grandi dimensioni di IUTx, dimostriamo che la somministrazione di PLC-mcoET3 all'equivalente di 16-18 settimane di gestazione (gw) nell'uomo, ha prodotto livelli elevati di FVIII plasmatico che superavano quelli del controllo non -Animali IUTx >48,4 ± 12,3%, per >3 anni dopo la nascita, nonostante il rapido e considerevole aumento di peso, senza evidenza di tossicità correlata alla terapia, né sviluppo di IgG anti-FVIII/ET3, inibitori del FVIII, o Celle Th1 o Th2 specifiche per ET3. Inoltre, abbiamo dimostrato che i riceventi trattati con IUTx non hanno sviluppato immunità o anticorpi anti-HLA nei confronti del PLC umano trapiantato, ma hanno mantenuto una robusta reattività verso gli antigeni estranei. L'analisi dell'RNA e del DNA ha dimostrato l'attecchimento e l'espressione continua del mcoET3 codificato dal vettore in tutti i principali organi. Questa terapia ha inoltre portato all'assenza di sanguinamento in una pecora HA, nonostante un parto difficile. Questi studi attestano quindi la fattibilità, il vantaggio immunologico e la sicurezza del trattamento dell’HA durante il periodo prenatale.

2 SD above the mean OD from ELISAs performed with control sheep plasma (dotted line). During the first year post-IUTx, none of the treated animals developed anti-ET3 IgM or IgG antibodies, but during year 2, c a low-titer (1:20) anti-ET3 IgG antibody was detected in one animal (17010). This animal was closely followed with subsequent anti-ET3 IgG antibody testing, and data showed that (d) the anti-ET3 IgG antibody measured at different time points (n = 5) was either a transient non-inhibitor antibody, since FVIII levels remained high, or an assay artifact as subsequent samples from this animal were devoid of anti-ET3 IgG. Data are shown as Mean ± SEM. Source data are provided as a Source Data file./p>2, and >10 SFU/2 × 105 PBMC (dotted line). IUTx recipients (n = 13 animals) had no ET3-specific Th1 or Th2 lymphocytes, while their lymphocytes maintained the ability to react and secrete IFN-γ and IL-4 when stimulated with Phytohemagglutinin-L (PHA-L); c None of the IUTx animals’ (n = 13 animals) lymphocytes proliferated in the presence of same-donor PLC-mcoET3 (T) or same-donor non-transduced PLC (NT), when tested by one-way MLRs, but maintained significant proliferative response to third party human PBMC. For each animal, MLR assays were performed in triplicate at two different time points. Data are shown as Mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test was used to determine significant differences. p ≤ 0.05 was considered significant. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. Source data are provided as a Source Data file./p>

0.999; 0.1818; 0.8041; spleen p = 0.0763; 0.0702; 0.1244; >0.9999; 0.9906; 0.9854; lung p = 0.0845; 0.8127; 0.8366; >0.9999; thymus p = 0.9818; 0.8695; 0.0755; 0.144; 0.9785. Source data are provided as a Source Data file./p>30% of PHA develop FVIII inhibitors28,29. Importantly, both persons with severe30 and non-severe HA31 who develop inhibitors have an increased mortality risk. Also of note is that some patients can experience spontaneous bleeding starting during the neonatal period or infancy. Reports show that 9.5% of HA newborns need replacement treatment within the first 24 h after birth, and 44% have a bleeding episode by 1 mo.26,27. Moreover, infants suffer cranial (24%), oral (30%), soft tissue (7%), and joint (16.2%) bleeds26,27. Thus, even a 5% increase in FVIII activity during the neonatal period could avert early bleeding events. Therefore, these patients could greatly benefit from early intervention./p>48.4 ± 12.3%, for >3 years after birth. The FVIII activity levels determined by FVIII activity assays were also confirmed by LC-MS, which, in addition, demonstrated that ET3 protein was present in the plasma of treated animals. Furthermore, in seven out of eight animals, FVIII levels at 1-year post-IUTx did not differ significantly from those at 3 years post-IUTx, and the one animal in which levels of FVIII declined still maintained FVIII levels >5% above normal. Interestingly, higher plasma FVIII levels were not detected in animals that received higher cell doses, or cells with higher FVIII secretion. Importantly, none of the treated animals developed anti-FVIII/ET3 IgM or IgGs, or ET3-specific Th1 or Th2 cells. This is in contrast to what was reported in another study using juvenile sheep that received the exact same therapy (PLC-mcoET3) by the same administration route (IP), and in which 66% of animals developed anti-FVIII/ET3 IgGs and low titers of anti-FVIII and anti-ET3 inhibitory antibodies13./p>15% FVIII, which is intended to provide effective protection from the majority of spontaneous bleeds25. Since at 3 years after IUTx, the average plasma levels of FVIII were 48.4 ± 12.3% above the control, this approach could also provide enough factor to control other acute bleeds, in particular, subclinical bleeds and those associated with traumas, surgery, and/or intense physical activity25. Nevertheless, confirmation of phenotypic correction by evaluating whether the annualized bleeding rate is significantly reduced from baseline throughout the lifetime of HA animals, and evidence that an immune response is still not present in these animals is a must to ascertain the true clinical impact of this prenatal approach./p> 5 IU./p>

2 SD above the mean OD from control sheep plasma (n = 4) Supplementary Fig. 7a, b./p>

2 (Stimulation Index >2); and (2) a threshold minimum of 10 SFU/2 × 105 PBMC was reached./p>

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